jenabioscience:高保真生物素16 PCR标记试剂盒  货号：APP-101-BIO16

PCR法制备生物素16标记的DNA探针

Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一组科学家于1998年成立，利用超过25年的学术知识为100多个国家的研究和行业客户开发创新试剂。

供一般实验室使用。

运输:凝胶包装运输

储存条件:储存在-20°C
避免冷冻/解冻循环

保质期:12个月

描述:
高保真生物素16 PCR标记试剂盒设计用于通过PCR随机产生生物素16修饰的DNA探针。这种探头非常适合于原地的杂交和Northern印迹实验。如果模板量有限或需要扩增特定的DNA片段，基于PCR的标记优于Klenow片段的随机引物标记。

使用优化的反应缓冲液和高保真聚合酶，生物素-16-dUTP作为其天然对应物dTTP的替代物被有效地整合到DNA中。50 %生物素-16-dUTP取代通常导致反应和标记效率之间的最佳平衡。然而，生物素-16-dUTP/dTTP比率的个体优化可以容易地用单核苷酸形式实现。所得生物素16-修饰的DNA探针随后可通过HRP-或AP-修饰的链霉亲和素检测。

该试剂盒包含足够的试剂用于175个标记反应，每个反应20μl(50%生物素16-dUTP替代，100微米dATP/dGTP/dCTP，50微米dTTP，50微米生物素16-dUTP)。

内容:
高保真聚合酶
在含有50%甘油(v/v)的储存缓冲液中
1个200微升(500个单位，2.5个单位/微升)

高保真标记缓冲液
1个500微升(10倍)

dATP溶液
1个20微升(100毫米)

dGTP解决方案
1个20微升(100毫米)

dCTP溶液
1个20微升(100毫米)

dTTP溶液
1个20微升(100毫米)

生物素-16-dUTP
1个200微升(1毫米)

DNA
1个20微升(100纳克/微升)

500 bp正向引物
1个20微升(10微米)

500 bp反向引物
1个20微升(10微米)

PCR级水
1x 1.2毫升

由用户提供
DNA模板
底漆
DNA纯化工具(可选)

1.工作溶液的制备

1.1 1mM dATP/dCTP/dGTP工作溶液的制备

• 将100 mM dATP、100 mM dCTP和100 mM dGTP溶液在冰上、voretex上解冻，并短暂旋转。
• 用PCR级水制备1:100的稀释液，以达到1 mM的最终浓度(例如2μl 100mM dATP+2μl 100mM dCTP+2μl 100mM dGTP+194μl PCR级水)。
• 1 mM ATP/CTP/GTP工作溶液可储存在-20°c下。准备等分试样以避免冷冻/解冻循环。

1.2 1mM dTTP工作溶液的制备

• 在冰上融化100 mM dTTP溶液，voretex并短暂旋转。
• 用PCR级水制备1:100的稀释液，以达到1 mM的最终浓度(例如2 μl 100 mM dTTP + 198 μl PCR级水)。
• 1 mM dTTP工作液可储存在-20°c下。准备等分试样以避免冷冻/解冻循环。

3.标准PCR标记方案

标准方案用于标记500 bp的DNA片段。反应和标记效率之间的最佳平衡通常是按照下面的标准方案用50%生物素-16-dUTP取代来实现的，然而，个体优化可能会改善个体应用的结果。

• 按照下列顺序在冰上组装PCR(无脱氧核糖核酸酶反应管)。
• Voretex和简单的降速。

推荐的骑行条件

1)退火温度取决于所用引物的熔化温度。
2)延伸时间取决于待扩增片段的长度。建议时间为2分钟/kbp。72°C时的伸长率也同样有效。

为了获得最佳扩增结果和高掺入率，对于每个新的引物-模板对，可能需要对推荐的PCR检测和循环条件进行单独优化。

4.探针纯化:

大多数杂交实验不需要探针纯化。如果下游应用需要纯化(例如通过吸光度测量进行浓度测定)，我们建议采用基于硅胶膜或凝胶过滤的纯化方法。

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