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| 问题 | 潜在原因 | 建议的解决方案 |
| 染色弱或缺失 | 细胞已从盖玻片上脱落 | - 洗涤时更加轻柔或减少洗涤次数 |
| 细胞通透性较差 | - 尝试增加 Triton X-100 的浓度 | |
| 细胞干涸 | - 确保在整个实验过程中细胞始终被过量的液体覆盖 | |
| 细胞过度固定 | - 减少细胞与固定剂一起孵育的时间 | |
| 一抗太少 | - 增加一抗浓度 | |
| 光照 | - 确保应用二抗后样品永远不会暴露在光线下 | |
| 二抗错误 | - 确保二抗对一抗的培养物种具有特异性 | |
靶细胞中不存在蛋白质 | - 检查文献以了解细胞群中是否预期存在蛋白质 | |
| 表位因固定而被遮盖 | - 尝试不同的固定剂 | |
| 曝光时间太短 | - 增加成像时的曝光时间和/或增益 | |
| 高背景 | 非特异性结合 | 尝试在没有一抗的情况下测试二抗，以确保二抗不会与细胞内的靶标结合 |
| 阻挡不良 | - 尝试更换封闭液 | |
| 抗体浓度过高 | - 尝试降低一抗浓度 | |
| 反应性醛基 | - 考虑在 PBS 孵育步骤中引入 1% NaBH4 | |
| 光谱重叠 | - 确保二抗的吸收/发射光谱不重叠 | |
| 洗涤不足 | - 增加二次孵育后的洗涤步骤 | |
| 非特异性染色 | 抗体与其他蛋白质中存在的表位结合 | - 尝试不同的抗体，看看染色模式是否相关。 |
| 抗体浓度过高 | - 尝试降低一抗和二抗浓度 | |
| 与内源性 IgG 的反应性 | - 尝试使用在细胞来源以外的物种中产生的抗体（尤其是在原代细胞培养物中） |
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