人线粒体转录因子A(TFAM)酶联免疫监测试剂盒说明书

用    途：用于人血清、血浆及相关液体样本中人线粒体转录因子 A(TFAM)测定。

工作原理

本试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法 (ELISA) 测定样品中 人线粒体转录因子 A(TFAM)水平。向预先包被了人线粒体转录因子 A(TFAM)单克 隆抗体的酶标孔中加入人线粒体转录因子 A(TFAM)，温育；温育后，加入生物素 标记的抗 TFAM 抗体。再与链霉亲和素-HRP 结合，形成免疫复合物，再经过温育 和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物 A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转 化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中人线粒体转录因子 A(TFAM)的浓度呈正相 关。

试剂盒组成

需要而未提供的试剂和器材

1．  37℃恒温箱。

2．  标准规格酶标仪。

3．  精密移液器及一次性吸头

4．  蒸馏水，

5．  一次性试管

6．  吸水纸

注意事项

1．  从 2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少 30 分钟。酶标包 被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．  各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差

3． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

4．  为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。

5．  不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

6．  底物 B 对光敏感，避免长时间暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下 用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少 0.35ml注入孔内，浸泡 1-2 分钟。根据需 要，重复此过程数次。

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中

标本要求

1．不能检测含NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的 (HRP) 活性。

2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实 验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

操作程序

1. 标准品的稀释： (本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小

试管中进行稀释。)

2. 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白 孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3. 加样：1) 空白孔，空白对照孔不加样品，生物素标记的抗 TFAM 抗体，链霉 亲和素-HRP，只加显色剂 A&B 和终止液，其余各步操作相同；2) 标准品孔： 加入标准品 50ul，链霉亲和素-HRP50ul(标准品中已事先整合好生物素抗体， 故不加)；3) 代测样品孔：加入样本 40ul，然后各加入抗 TFAM 抗体 10ul、 链霉亲和素-HRP50ul，盖上封板膜，轻轻震荡混匀，37℃温育 60 分钟。

4. 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用。

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后 弃去，如此重复 5 次，拍干。

6. 显色：每孔先加入显色剂A50ul，再加入显色剂 B50 μ l，轻轻震荡混匀，37℃ 避光显色 15 分钟.

7. 终止：每孔加终止液 50 μ l，终止反应 (此时蓝色立转黄色) 。

8. 测定： 以空白孔调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度 (OD 值) 。  测定 应在加终止液后 10 分钟以内进行。

9. 根据标准品的浓度及对应的OD 值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据 样品的OD 值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软 件来计算。

操作程序总结：

1.准备试剂，样品和标准品

2.加入准备好的样品和标准品，生物素标记的二抗和酶标试剂，37℃反应60分钟

3.洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色15分钟

4.加入终止液

5.10分钟内读OD值

6.计算

试剂盒性能：

1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.92 以上。

2.批内与批间应分别小于9%和 15%

检测范围：

检测范围：     10pg/ml-320pg/ml

保存条件及有效期：

保存：2-8℃。

有效期：6 个月(2-8℃)。